诺禾10x单细胞转录组---分析方案大放送

单细胞测序技术日渐火爆,其相关文章也层出不穷。随着越来越多相关研究的出现,也有更多的科研工作者对其产生了兴趣。为了响应广大科研工作者的需求,诺禾致源倾力打造单细胞一站式解决方案,从样本制备到个性化分析全面助力您的研究!

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单细胞测序技术应用之初,其研究主要集中在探索组织器官内部结构,从而获得其精细的细胞图谱,例如浙江大学郭国骥团队分别CELL和NATURE杂志发表了首个小鼠细胞图谱[1]和涵盖八大系统的人类细胞图谱[2]。随着组织图谱的不断完善,大家关注的重点转向了利用单细胞测序技术去解决真正的科学及临床问题,例如疾病、肿瘤的致病机制和药物的作用机理等等。

那么如何利用单细胞技术去解决这些科学/临床问题呢?分析当前已经发表的单细胞文章及诺禾丰富的项目经验,不难发现其研究思路大同小异。我们总结了一套单细胞转录组通用的分析方案分享给关注小诺的各位。

接下来我们就从拿到一个课题中所有样本单细胞测序的数据开始,给大家展示一下常规课题分析思路。

一、整合分析

利用单细胞测序技术解决科学/临床问题的课题中,一般会有2组或2组以上(例如:正常对照组vs 疾病组)的样本。首先需要将一个课题中所有的样本整合到一起进行分析,然后降维聚类获得整个课题样本的分群图(拿到每个样本的分群图就会发现每个样本分群图的形状都不一样,整合分析就避免了这一问题),方便后续的分析。

诺禾单细胞研究部开发了不同的样本整合方法,例如PCA、CCA、Harmony等可以分别对样本间的批次效应进行不同程度的较正,以满足不同课题的需要。下面这两张图是诺禾利用10X官方demo数据将两个PBMC样本整合后的细胞分群图。

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二、细胞定义

获得细胞分群图之后,需要根据每个群的基因表达特征定义出每个用数字标记的小群具体是哪种类型的细胞,最终获得样本的组织细胞图谱。关于细胞定义可参考《细胞定义鹊桥相会——算法开发与自建数据库》。

三、寻找组间差异

接下来就是找到整个课题中不同组别之间的差异,找到关键的细胞亚群或者基因,来解释科学/临床问题。本次先介绍如下三个方面:

A. 细胞占比分析

通过对多样本细胞占比分析,可以直观的看出每个细胞群在不同样本中的占比情况,发现在不同组别中占比发生明显变化的细胞亚群或者新的细胞群,并将该cluster作为进一步研究的重点。

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细胞占比示例图[3]

B.差异基因分析

通过差异分析,分析不同样本细胞群之间的基因表达差异,进一步分析探究得到这些基因表达出现差异是由哪些生物学过程介导的。

此外可以分析某些功能相关基因集的表达,看这些关注的基因集在哪个细胞群中高表达。

C.结合V(D)J分析克隆型变化

在免疫微环境研究中,结合TCR/BCR克隆型的变化,找到关注的细胞亚群。

四、细胞间进化关系分析

在进行组织发育进化研究时,可以通过拟时分析或者RNA速率分析去分析组织内各cluster之间的进化关系。

A. 拟时分析

拟时分析可以推断发育过程中细胞分化轨迹或免疫微环境中细胞亚型的演化过程,将其过程以树状图的形式展示出来。

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拟时分析示例图[4]

B. RNA速率分析

RNA velocyto速率是基因表达状态的时间变率,可以通过区分普通单细胞RNA测序中未剪接和剪接的mRNA来直接进行分析诸如胚胎发育或组织再生等随时间变化的现象。

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RNA速率分析示例图[5]

五、细胞间相互作用分析

组织器官内的各细胞亚群并不是单独存在的,各亚群细胞相互作用共同维持组织结构发挥功能。通过分析细胞膜表面受体和配体相互作用,来推断细胞之间的相互作用。例如找到不同细胞间相互作用的中心,为深入研究疾病的发生机制或药物的作用机制指明方向。

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受配体分析示例图[6]

六、单细胞测序结果的验证

通过单细胞分析得到的结果,还需要通过进一步的验证,可以通过流式分选验证单细胞结果,流式分选结合Bulk测序分子实验验证基因表达,分子实验验证细胞间作用。

以上内容为本次小诺给大家介绍的关于单细胞分析方案的主要内容,通过整理总结得到如下分析流程图可供各位老师参考。另外,诺禾单细胞在接下来还会陆续为大家分享一些个性化的分析流程,敬请期待吧!

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参考文献

[1] Han X, Wang R, Zhou Y, Fei L, et al. Mapping the Mouse Cell Atlas by Microwell-seq [J]. Cell. 2018, 172: 1091–1107.

[2] Han, X., Zhou, Z., Fei, L. et al. Construction of a human cell landscape at single-cell level. Nature 581, 303–309 (2020).

[3] Christopher S. Smillie, Moshe Biton, Jose Ordovas-Montanes, et al. Intra- and Inter-cellular Rewiring of the Human Colon during Ulcerative Colitis.Cell.2019.

[4] Robert A. Carter,Laure Bihannic,Celeste Rosencrance, Jennifer L, et al. A Single-Cell Transcriptional Atlas of the Developing Murine Cerebellum, Cell.2020.

[5] Ramachandran P ,  Dobie R ,  Wilson-Kanamori J R , et al. Resolving the fibrotic niche of human liver cirrhosis at single-cell level[J]. Nature. 2019.

[6] Xiong X ,  Kuang H ,  Ansari S , et al. Landscape of Intercellular Crosstalk in Healthy and NASH Liver Revealed by Single-Cell Secretome Gene Analysis[J]. Molecular Cell, 2019, 75(3):644-660.e5.

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