标记蛋白组 VS label free蛋白组学

非靶向蛋白组定量分析,分为两类,近年来比较热门的应该是以iTRAQ和TMT为代表的标记技术。第二类是非标记(Label free)蛋白定量,他们有什么区别呢?

1、iTRAQ的肽段标记 V.S. Lable free的无标记——iTRAQ容易引入实验误差,也会受到标签种类限制。

iTRAQ由于实验需要,会在蛋白样本酶解成肽段后,给不同样本的肽段标记上等重同位素标签(图1);Label free不对样本进行标记(图2)。标记步骤使得iTRAQ技术在第一步引入实验误差,而且标签种类(8个)限制了iTRAQ一批次比较的样品个数。

标记蛋白组 VS label free蛋白组学_第1张图片

                                                                                图1 iTRAQ流程示意图

蛋白提取-酶解-标记-混合上机-标签碎裂-通过二级谱图报告集团峰强度定量


标记蛋白组 VS label free蛋白组学_第2张图片

                                                                                图2 label free流程示意图

蛋白提取-酶解-样本分别上机-通过比较样本的峰面积定量

2、iTRAQ样本混合上机 V.S. Label free升级版样本分别上机——10个样本以内的定量比较,Label free升级版再准,也难超iTRAQ。

iTRAQ标记后样本混合上机,避免分批次上机引入的实验误差,理论上可实现100%平行比较;label free升级版样本分别上机,即便是使用高稳定性质谱仪和iRT矫正工具,理论上也无法实现100%的平行比较。(参考图1、2)

3、iTRAQ液相色谱(LC)分组分 V.S. Label free升级版不分组——iTRAQ分组分鉴定率高,Label free升级版不分组鉴定难度大,需增加谱图库的建库成本。

iTRAQ在LC-MS/MS前进行一向液相色谱分多个(一般为20个)组分,充分降低样本复杂程度,鉴定效果好;Label free升级版为了压缩单个样本上机时间,一般不进行一向液相色谱分组,样本复杂程度相对较高,鉴定难度大。

为了获得更好的鉴定效果,Label free升级版在样本上机前需要构建一个分组的混合样品库,辅助进行样本的蛋白鉴定,完美解决样本鉴定难度大的问题,但会增加成本。

4、iTRAQ DDA V.S. Label free升级版 DIA——DIA模式完胜,但DIA数据处理难度大。

iTRAQ采用数据非依赖性采集(Data-dependent acquisition, DDA),数据会有不全面性和随机性;Label free升级版采用DIA模式,数据相对完整,重复性好,但数据处理难度大。(图3)

标记蛋白组 VS label free蛋白组学_第3张图片

图3 DDA vs DIA

DDA挑选一级谱中强度最强的20-30个离子进行二级质谱,母子离子对具备一一对应关系;

而DIA选择一定荷质比范围内全部的离子进行二级质谱碎裂,母子离子不具备一一对应关系。

DIA数据采集,依赖于质谱仪的扫描速度和分辨率,需配备高性能质谱仪(如Q Exective HF);DIA模式的数据采集,会产生大量的数据,给分析带来很大困难,专业分析软件(如Spectronaut)才能处理这些数据。

通过DIA模式采集到的数据,可重复利用其进行分析,不会受限于时空差异;而DDA模式的数据,受限制比较大,一般不同时间不同地点采集到的数据,无法同时进行比较。

5、iTRAQ信号强度定量 V.S. Label free升级版二级质谱峰面积定量——Label free定量更准确。

iTRAQ根据二级质谱的标签断裂后的碎片信号强度进行定量,定量标准一致,但也存在降低二级肽段碎片信号的可能,影响鉴定效果;label free升级版根据肽段碎片的质谱峰面积进行定量(图4),定量依据更丰富,定量更准确。

标记蛋白组 VS label free蛋白组学_第4张图片

                                                                            图4 DIA定量方式

综上,科技君给大家总结一下,以下情况可优先选择iTRAQ:

1、实验组数低于8组(即同时比较的样本数≤8)

2、样本背景极为相似(相同物种和相同的样本类型)

3、经费有限,需要通过高性价比方案完成研究

更适合选择Label free升级版的情况:

1、实验组数高于10组

2、不同物种、不同来源或部位的样本,需要同时进行蛋白组分析和定量

3、需要区分样本中的“有无蛋白”

4、追求更精准的定性定量效果,避免标记和液相分组引入的实验误差

5、需要对采集的数据进行多次分析

一、iTraq(4、8标)或TMT(6、10标)标记蛋白组特点:

1、混合上机,平行性好。

2、经过分级,LC-MS分辨率高,效果更好。

3、性价比高。

二、label free蛋白组学特点:

1、没有标签数量限制,也不会因此引入实验误差。

2、DIA模式将全部离子二级碎裂,信息更全。

3、iTRAQ根据二级质谱的标签断裂后的碎片信号强度进行定量,label free升级版根据肽段碎片的质谱峰面积进行定量,定量依据更丰富,定量更准确。

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